The initiation of bud burst in grapevine features dynamic regulation of the apoplastic pore size  

葡萄芽爆發(fā)啟動(dòng)過程具有胞外連絲孔徑的動(dòng)態(tài)調(diào)控特征  

來源: Journal of Experimental Botany, Volume 71, No 2, 2020, Pages 719-729

《實(shí)驗(yàn)植物學(xué)雜志》第71卷第2期，2020年，第719-729頁，  

 

摘要  

本研究揭示了葡萄芽爆發(fā)過程中胞外連絲孔徑的動(dòng)態(tài)調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)休眠期葡萄芽的胞外連絲孔徑限制為2.1納米，僅允許單糖和植物激素等小分子通過，而較大分子（如酸性品紅和伊紅Y染料）需待芽爆發(fā)啟動(dòng)后才能傳輸。通過微計(jì)算機(jī)斷層掃描（μCT）技術(shù)證實(shí)芽內(nèi)部氧分壓（pO?）分布與組織異質(zhì)性高度相關(guān)，初級(jí)芽復(fù)合體在爆發(fā)過程中優(yōu)先快速氧合。結(jié)果表明胞外連絲孔隙度在芽爆發(fā)早期受到嚴(yán)格調(diào)控，說明維管發(fā)育在初級(jí)芽復(fù)合體的初始快速氧合過程中起關(guān)鍵作用。

 

研究目的  

探究：1）葡萄芽爆發(fā)過程中胞外連絲孔徑的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律；2）光照和氧分壓對(duì)芽爆發(fā)啟動(dòng)的調(diào)控作用；3）芽內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)異質(zhì)性對(duì)氧分布的影響機(jī)制。

 

研究思路  

1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：采集休眠期葡萄藤莖段（梅洛品種），使用氫氰酰胺（HC）處理同步化芽爆發(fā)進(jìn)程，設(shè)置黑暗（D）和光暗交替（DL）兩種培養(yǎng)條件  

2. 多技術(shù)聯(lián)用：  

   ? 染料傳輸實(shí)驗(yàn)：使用酸性品紅（0.8 nm）和伊紅Y（1.5 nm）評(píng)估胞外連絲通透性  

 

   ? 計(jì)算化學(xué)建模：B3LYP/6-31G(d,p)方法計(jì)算染料分子水合尺寸  

 

   ? μCT掃描：解析芽內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)并與氧分壓數(shù)據(jù)耦合  

 

   ? 呼吸測量：Li-COR系統(tǒng)測CO?釋放，Unisense微傳感器測O?消耗  

 

3. 數(shù)據(jù)分析：通過ANOVA和Tukey檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)不同組織孔隙度、濕度及呼吸速率差異  

 

測量的數(shù)據(jù)及研究意義  

1. 胞外連絲通透性（圖1B-C）：  

   ? 測量數(shù)據(jù)：休眠芽完全阻隔染料傳輸直至爆發(fā)啟動(dòng)（168 h），DL條件比D條件更早出現(xiàn)傳輸能力  

   ? 研究意義：首次量化芽休眠期的分子排阻尺寸（2.1 nm），證實(shí)胞外連絲是調(diào)控芽與母體物質(zhì)交換的關(guān)鍵屏障  

 

2. 分子尺寸建模（圖2-3）：  

   ? 測量數(shù)據(jù)：酸性品紅和伊紅Y的水合直徑分別為1.48 nm和2.12 nm，rhodamine green（陽性對(duì)照）為1.32 nm  

   ? 研究意義：通過量子化學(xué)計(jì)算精確確定染料分子的傳輸門檻值，為胞外連絲孔徑研究提供理論基準(zhǔn)  

 

 

3. 內(nèi)部氧分壓分布（圖4）：  

   ? 測量數(shù)據(jù)：芽分生組織核心區(qū)（2000-2400 μm深度）pO?在爆發(fā)啟動(dòng)后顯著升高，DL條件下外周區(qū)pO?比D條件高5 kPa  

   ? 研究意義：μCT重建電極路徑證實(shí)pO?空間異質(zhì)性與組織密度相關(guān)，揭示分生組織優(yōu)先氧合現(xiàn)象  

 

4. 組織孔隙度特征（圖5）：  

   ? 測量數(shù)據(jù)： trichomes（毛狀體）孔隙度最高（77%），外層鱗片30%，綠色組織12%；基部孔隙度最低（8-10%）  

   ? 研究意義：高孔隙度組織（如trichomes）可能作為氧氣擴(kuò)散通道，支持分生組織氧合  

 

 

結(jié)論  

1. 葡萄芽休眠期通過維持2.1 nm胞外連絲孔徑實(shí)現(xiàn)物理隔離，僅允許小分子物質(zhì)（單糖、植物激素）通過，而阻斷大分子信號(hào)物質(zhì)傳輸  

2. 光照通過促進(jìn)纖維素酶基因表達(dá)（DL條件表達(dá)量比D條件高48%）加速胞外連絲孔徑擴(kuò)大，但非芽爆發(fā)的絕對(duì)需求因子  

3. 芽爆發(fā)啟動(dòng)后分生組織核心區(qū)優(yōu)先氧合，且氧合過程不依賴原位光合作用（黑暗條件下仍發(fā)生），表明維管組織重建是氧合的主要途徑  

4. 組織孔隙度異質(zhì)性（trichomes > 鱗片 > 分生組織）是導(dǎo)致pO?空間分布差異的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，證實(shí)物理結(jié)構(gòu)與生理過程的耦合調(diào)控機(jī)制  

 

使用丹麥Unisense電極測量數(shù)據(jù)的研究意義  

本研究采用丹麥Unisense公司Clark型氧微傳感器（tip diameter: 25 μm）進(jìn)行關(guān)鍵測量：  

 

1. 高空間分辨率測量：  

   ? 傳感器以36 μm步長穿透芽組織（深度2900-3700 μm），實(shí)現(xiàn)分生組織核心區(qū)的原位pO?測量（圖4），克服了傳統(tǒng)方法的空間限制  

 

2. 精準(zhǔn)校準(zhǔn)技術(shù)：  

   ? 通過N?沖洗（0 kPa校準(zhǔn)）和大氣平衡（21 kPa校準(zhǔn)）實(shí)現(xiàn)兩點(diǎn)校準(zhǔn)，確保絕對(duì)pO?值的可靠性  

 

   ? 每日測量空白腔室本底值并扣除，消除系統(tǒng)誤差（方法2.3節(jié)）  

 

3. 與結(jié)構(gòu)生物學(xué)融合：  

   ? 通過μCT掃描碘染色樣品（7.9 μm分辨率）重建電極路徑（圖4A），首次將pO?曲線與組織密度定量關(guān)聯(lián)（圖4C）  

 

   ? 發(fā)現(xiàn)pO?最低值對(duì)應(yīng)高密度苞片組織（圖4B），證實(shí)組織結(jié)構(gòu)是氧分布的主要決定因子  

 

4. 揭示生理機(jī)制：  

   ? 測量顯示芽爆發(fā)初期（48 h）出現(xiàn)pO?低谷，隨后氧合水平顯著上升，匹配缺氧響應(yīng)基因表達(dá)峰值時(shí)間點(diǎn)  

 

   ? DL條件中外周區(qū)pO?更高（>15 kPa vs <10 kPa），證明光照通過促進(jìn)外周組織氧合間接影響芽爆發(fā)進(jìn)程  

 

Unisense微傳感器在本研究中發(fā)揮了不可替代的作用：其微米級(jí)空間分辨率成功解析了芽組織內(nèi)部的氧梯度異質(zhì)性，與μCT的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)耦合揭示了"分生組織優(yōu)先氧合"這一關(guān)鍵現(xiàn)象，證實(shí)了維管發(fā)育而非光合作用是芽爆發(fā)初期氧合的主要驅(qū)動(dòng)力。這些數(shù)據(jù)為理解木本植物芽爆發(fā)的氧調(diào)控機(jī)制提供了直接實(shí)驗(yàn)證據(jù)。