3結(jié)果

3.1間充質(zhì)干細(xì)胞球體內(nèi)氧氣分布的數(shù)值模擬

圖1(d)測量的氧分壓值與球面距離的函數(shù)關(guān)系。(e)利用測得的氧分壓值，通過公式(2.5)從每個(gè)球面尺寸的平均數(shù)據(jù)生成數(shù)學(xué)模型，并與球面內(nèi)各點(diǎn)的平均氧分壓值一起繪制。(f)根據(jù)測得的氧分壓值計(jì)算每個(gè)球面的K/D。(g)通過將數(shù)學(xué)模型映射到適當(dāng)直徑的球體橫截面上，在三維空間中顯示氧分壓與半徑的函數(shù)關(guān)系。刻度線代表250μm。

對不同大小的球體每隔10μm測量一次氧分壓(圖1d)。培養(yǎng)基中氧分壓的實(shí)驗(yàn)測量值為267μM O2，不同大小的球體中氧分壓保持不變。在分析之前，將球體從懸掛的液滴轉(zhuǎn)移到顯微載玻片上。15000細(xì)胞球體和30000細(xì)胞球體之間的氧分壓梯度沒有明顯差異，而60000細(xì)胞球體的氧分壓下降速度幾乎是15000細(xì)胞球體和30000細(xì)胞球體的兩倍。數(shù)據(jù)歸一化為非尺寸單位r/R，根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用公式(2.5)為每個(gè)球面生成數(shù)學(xué)模型(圖1e)。計(jì)算出每個(gè)球面的α、β和γ值，然后用來計(jì)算b和K/D。對于所有三種大小的球面，我們確定γ全等于0，表明b=0。在這些研究中，我們將缺氧定義為允許細(xì)胞存活和發(fā)揮作用的臨界氧分壓。如果細(xì)胞不再具有活力，那么它們就無法消耗氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，因此b值代表了缺氧核心的邊界，在這個(gè)邊界上，dC/dr=0。因此，由于這些間充質(zhì)干細(xì)胞球體的b=0，這些研究結(jié)果表明這些球體內(nèi)不存在缺氧核心。

雖然球體內(nèi)明顯存在梯度，而且隨著球體尺寸的增大，梯度也會(huì)隨之增大，但在每個(gè)含有60000個(gè)細(xì)胞的最大球體內(nèi)，外層細(xì)胞與內(nèi)核之間的氧分壓下降不到10%。無論球體直徑大小如何，氧分壓值在中心點(diǎn)之前都沒有接近dC/dr=0的點(diǎn)，這表明這些球體沒有表現(xiàn)出氧氣傳質(zhì)的限制。然后利用數(shù)學(xué)模型中的a和b系數(shù)計(jì)算每個(gè)球體的K/D。與其他兩種尺寸的球體相比，最小的球體(每個(gè)球體有15000個(gè)細(xì)胞)的K/D值有所增加，這表明如果假定不同直徑的球體內(nèi)氧氣消耗的反應(yīng)速率不變，則擴(kuò)散系數(shù)較小(圖1f)。利用方程(2.4)對各點(diǎn)的K/D進(jìn)行數(shù)值求解，驗(yàn)證了這一假設(shè)(數(shù)據(jù)未顯示)。為使三維氧梯度可視化，將數(shù)值數(shù)據(jù)映射到球體中平面的橫截面上，改變球體直徑，使其與每種尺寸的球體平均直徑一致(圖1g)。

3.2堆積密度隨球面尺寸增大而降低

圖2球粒堆積密度隨著球粒尺寸的增大而減小。(a)計(jì)算了假設(shè)最大堆積密度的預(yù)測球面半徑，并與測量的球面半徑一起報(bào)告。(b)隨著球面尺寸的增大，堆積密度明顯降低。(c)DNA含量隨每個(gè)球形體細(xì)胞數(shù)的增加而線性增加。(d)歸一化蛋白質(zhì)含量隨著球形體大小的增加而減少。(e)H&E染色顯示，15000細(xì)胞球體(i)比較大的30000細(xì)胞球體(ii)和60000細(xì)胞球體(iii)更緊湊。標(biāo)尺條代表250μm。

我們注意到，測得的半徑與每個(gè)球形體的細(xì)胞數(shù)并不呈立方關(guān)系。為了直觀地說明這一點(diǎn)，我們使用公式(2.6)計(jì)算了假設(shè)最大堆積密度的預(yù)測球形半徑，并將其與測量半徑繪制成圖(圖2a)。較小球體(每個(gè)球體15000個(gè)細(xì)胞)的測量半徑與預(yù)測半徑相關(guān)性良好，但30000個(gè)和60000個(gè)細(xì)胞球體的測量半徑分別比相應(yīng)的預(yù)測半徑大16%和25%。從這些數(shù)據(jù)可以看出，間充質(zhì)干細(xì)胞球體的堆積密度一定會(huì)隨著球體大小的增加而降低，從而使氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)更容易滲透到球體中心。因此，我們使用公式(2.7)計(jì)算了堆積密度，并證實(shí)隨著每個(gè)球形細(xì)胞數(shù)量的增加，細(xì)胞在球體內(nèi)的堆積密度明顯降低(圖2b)。為了驗(yàn)證球體直徑的差異是由于堆積密度而非細(xì)胞增殖造成的，我們對DNA含量進(jìn)行了量化，作為每個(gè)球體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的指標(biāo)。DNA含量與每個(gè)球體內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量相關(guān)(R2=0.964)，證實(shí)每個(gè)液滴中的所有間充質(zhì)干細(xì)胞都融入了球體內(nèi)，在球體形成過程中細(xì)胞數(shù)量沒有增加(圖2c)。每個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)含量隨著堆積密度的降低而減少(圖2d)，這表明在較大的球體內(nèi)ECM含量相對減少。使用血紅素和伊紅(H&E)可進(jìn)一步觀察細(xì)胞的堆積密度和ECM含量，隨著球體尺寸的增大，整個(gè)球體結(jié)構(gòu)中的許多空腔變得更加明顯。H&E染色還顯示，在所有三種尺寸的球形體中，外層細(xì)胞看起來比內(nèi)部細(xì)胞更密集，更細(xì)長，而且隨著直徑的增加，球形體的球形度普遍降低(圖2e)。

3.3細(xì)胞活力和新陳代謝活性隨著球形體大小的增加而降低

圖3細(xì)胞存活和葡萄糖消耗受球形大小的影響。(a)間充質(zhì)干細(xì)胞球體內(nèi)Caspase 3/7酶活性，(b)葡萄糖總消耗量，(c)L-乳酸總產(chǎn)生量。

與較小的15000個(gè)和30000個(gè)細(xì)胞的球形體相比，最大的球形體(每個(gè)球形體有60000個(gè)細(xì)胞)顯示出更高的Caspase活性，表明細(xì)胞凋亡(圖3a)。通過測量葡萄糖消耗量和乳酸鹽產(chǎn)生量，研究了球形細(xì)胞的有氧狀態(tài)。總葡萄糖消耗量隨著球體大小的增加而明顯減少，15000細(xì)胞球體的葡萄糖消耗量比較大的60000細(xì)胞球體高出約四倍(圖3b)。細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和6-磷酸葡萄糖水平的測量結(jié)果表明，較大的球體消耗的葡萄糖比較小的球體少。細(xì)胞內(nèi)葡萄糖測量的是瞬時(shí)水平，而不是兩天內(nèi)的葡萄糖總消耗量，因此與葡萄糖總消耗量相比有數(shù)量級的減少。L型乳酸鹽的總產(chǎn)生量與葡萄糖消耗量的趨勢相同(圖3c)。由于α-MEM中不存在L-乳酸，所有L-乳酸都是細(xì)胞代謝的結(jié)果。無論球形體大小如何，所有組從葡萄糖中產(chǎn)生的乳酸產(chǎn)量相似。

3.4細(xì)胞存活率和缺氧的組織學(xué)檢測

圖4細(xì)胞存活率的組織學(xué)分析表明，不同直徑的球體之間沒有明顯差異。(a)活細(xì)胞(綠色)/死細(xì)胞(紅色)染色顯示，15000個(gè)、30000個(gè)和60000個(gè)細(xì)胞球體內(nèi)的間充質(zhì)干細(xì)胞存活率相同。一個(gè)60000細(xì)胞球體在甲醇中孵育，作為碘化丙啶的陽性對照(最右邊)。(b)Annexin V(紅色)和DAPI(藍(lán)色)染色進(jìn)一步驗(yàn)證了沒有細(xì)胞凋亡，因?yàn)?5000、30000和60000細(xì)胞球體的球心和外圍都沒有陽性染色。500000個(gè)細(xì)胞球體作為附件素V的陽性對照。標(biāo)尺條代表500μm；圖像使用20×物鏡拍攝。(c)細(xì)胞凋亡指數(shù)的量化，以核心相對于外圍的附件素V陽性染色面積計(jì)算。

使用活/死染料觀察球體內(nèi)的細(xì)胞活力，結(jié)果顯示不同大小的球體之間沒有明顯差異。將較大球體內(nèi)沒有死細(xì)胞的情況與陽性對照進(jìn)行比較后進(jìn)一步得到了驗(yàn)證，陽性對照是將每個(gè)球體內(nèi)含有60000個(gè)細(xì)胞的球體放入70%甲醇中培養(yǎng)，以便在使用活體/死體染料培養(yǎng)前殺死細(xì)胞(圖4a)。從這些圖像中可以看出，每個(gè)球體內(nèi)的細(xì)胞都是活的。甲醇溶液導(dǎo)致陽性對照組的球形細(xì)胞收縮，形成長圓形。附件素V染色進(jìn)一步證實(shí)，15000、30000和60000個(gè)細(xì)胞的球形核心內(nèi)沒有凋亡細(xì)胞(圖4b、c)。這些結(jié)果與我們量化Caspase3/7蛋白酶活性的數(shù)據(jù)略有不同，后者表明細(xì)胞正在積極凋亡。Caspase活性的靈敏度很高，而且是以相對發(fā)光的形式測量的，因此它更有價(jià)值用于比較樣本內(nèi)的情況，而不是斷定是否存在細(xì)胞凋亡，因?yàn)樗屑?xì)胞群都有一個(gè)凋亡活性基線。

圖5缺氧組織學(xué)分析表明，不同直徑的球體之間沒有明顯差異。Pimonidazole(綠色)和DAPI(藍(lán)色)染色進(jìn)一步驗(yàn)證了15000、30000和60000細(xì)胞球體內(nèi)沒有缺氧核心。一個(gè)60000細(xì)胞球體在1%氧氣中培養(yǎng)5天，作為皮尼達(dá)唑染色的陽性對照(右圖)。刻度線代表500μm；圖像使用20×物鏡拍攝。

免疫組化染色進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的氧分壓測量結(jié)果，并驗(yàn)證了缺氧核心的存在，因?yàn)槿魏吻蝮w內(nèi)都沒有皮尼達(dá)唑染色(圖5)。Pimonidazole對低于14μM O2的區(qū)域進(jìn)行熒光標(biāo)記，常用于癌細(xì)胞球和肝細(xì)胞球，以劃分缺氧核心的邊界。因此，沒有熒光信號表明這些球體內(nèi)不存在缺氧核心。陽性對照組(每個(gè)球形體有60,000個(gè)細(xì)胞，收集前在1%氧氣中培養(yǎng)5天)產(chǎn)生的球形體更松散、更小，這可能是由于培養(yǎng)基沒有更新，細(xì)胞死亡程度高所致。

為了確定直徑更大的球形體是否會(huì)在其核心部位出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡和缺氧，我們分別形成了100000、250000和500000個(gè)細(xì)胞的球形體，并對其進(jìn)行了附件素V和波尼噠唑染色。與本文報(bào)告的15000、30000和60000個(gè)細(xì)胞球體的結(jié)果不同，從每個(gè)球體250000個(gè)細(xì)胞的大小開始，就觀察到了統(tǒng)計(jì)意義上顯著的缺氧核心(補(bǔ)充材料，圖S2)，這與核心中顯著的附件素V信號相關(guān)。這些結(jié)果表明，間充質(zhì)干細(xì)胞球體內(nèi)確實(shí)存在缺氧核心，并與細(xì)胞凋亡增加有關(guān)，但只有在比本文研究的細(xì)胞體積大得多的情況下才會(huì)出現(xiàn)。