熱線：021-66110810,66110819
手機(jī)：13564362870
結(jié)果：
1.小鼠動脈血和靜脈血中的H2氣體濃度
圖2：小鼠吸入2%H2后動脈血和靜脈血中H2濃度變化。
在假手術(shù)或CLP手術(shù)后1 h，分別于H2開始吸入后0、10、20、30、45、60、120、180 min和H2停止吸入后5、15、30、45、60 min，通過氫氣電極測定小鼠(A)動脈血和(B)靜脈血中的H2濃度。
術(shù)后1小時，小鼠動脈中H2氣體濃度并測量靜脈血樣。如圖2A和B所示，假+H2和CLP+H2組小鼠的H2濃度從動脈和靜脈血樣中H2吸入開始，從0到45分鐘逐漸增加。H2濃度在吸入H2 45分鐘時達(dá)到峰值，在開始吸入H2后的45至180分鐘內(nèi)，動脈血和靜脈血樣本中的H2濃度均維持在最高水平。吸入H2結(jié)束后，假+H2組和CLP+H2組小鼠動脈血和靜脈血中的H2濃度迅速降至基線水平（圖2A和B）。然而，CLP+H2組和假+H2組之間沒有觀察到明顯的差異。
2.FUNDC1和p-18-FUNDC1的表達(dá)水平
圖3：吸入H2對小鼠肝組織中FUNDC1和P-18-FUNDC1表達(dá)水平的影響。
假手術(shù)或CLP手術(shù)后6小時，取肝標(biāo)本。western blotting檢測FUNDC1和P-18-FUNDC1水平(A)定量分析(B)FUNDC1和(C)P-18-FUNDC1表達(dá)為蛋白密度相對于GAPDH密度的比值。
手術(shù)后6小時，用Western印跡法評估FUNDC1和p-18FUNDC1的蛋白水平（圖3A）。盲腸結(jié)扎組小鼠的FUNDC1和p-18-FUNDC1水平低于假組（圖3B-C）。然而，與中性粒細(xì)胞白蛋白組相比，2%H2處理可降低中性粒細(xì)胞白蛋白+H2組小鼠的FUNDC1和p-18-FUNDC1表達(dá)水平（圖3B-C）。
3.存活率
圖4：吸入H2對小鼠7天存活率的影響，觀察不同治療組小鼠7 d的存活率。
在為期7天的實(shí)驗(yàn)觀察中，假組只有一只小鼠死亡。此外，與假組相比，盲腸結(jié)扎組小鼠的7天存活率明顯下降。與CLP組相比，CLP+H2組在吸入2%H2后的7天存活率明顯提高。然而，CLP+肽P組和CLP+H2+肽P組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（圖4）。
4.肝損傷
圖5：吸入H2對小鼠肝組織及血清肝損傷的影響。
假手術(shù)或CLP手術(shù)后6 h處死小鼠，取肝組織進(jìn)行(A)HE染色(原放大×200)。通過觀察肝形態(tài)結(jié)構(gòu)(B)對肝損傷進(jìn)行評分。采集小鼠血清樣本檢測ALT(C)和AST(D)水平。
我們使用HE染色法評估假手術(shù)或CLP手術(shù)后6小時肝組織的組織病理學(xué)變化（圖5A）。正常小鼠的肝組織沒有明顯變化。在CLP組，大面積肝小葉出現(xiàn)了與肝損傷相關(guān)的形態(tài)學(xué)變化，包括斑點(diǎn)狀壞死和囊膜炎。然而，與CLP組相比，CLP+H2組小鼠的損傷明顯減輕（圖5B）。此外，血清樣本中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平也用于評估肝損傷狀況。與假組小鼠相比，CLP組小鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平明顯升高（圖5C和D），而吸入2%H2組小鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平明顯下降（圖5C和D）。然而，CLP+肽P組與CLP+H2+肽P組之間的病理評分和ALT、AST表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異（圖5B-D）。因此，肽P可以抑制H2對敗血癥小鼠肝損傷的治療作用。
5.線粒體呼吸
圖6：吸入H2對小鼠肝組織線粒體呼吸的影響。
術(shù)后6 h分離肝臟線粒體。(A)通過Oroboros Oxygraph-2K儀器評估耗氧量，(B)呼吸控制率(RCR)計算為狀態(tài)3與狀態(tài)4的比值。
手術(shù)6小時后，分離肝臟線粒體并評估線粒體呼吸水平（圖6A）。RCR級別CLP組小鼠的減少與CLP組相比假手術(shù)組（圖6B），但2%H2處理改善了CLP+H2組小鼠的RCR水平（圖6B）。CLP+肽P組和CLP+H2+肽P組的小鼠之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（圖6B）。
6.P62、LC3B-II、Tim23和caspase-1的蛋白質(zhì)水平
圖7：吸入H2對小鼠P62、LC3B-II、Tim23和caspase-1表達(dá)水平的影響。在假手術(shù)或CLP手術(shù)后6 h收集各組肝臟組織，(A)用western blotting檢測有絲分裂相關(guān)蛋白的表達(dá)。(B)P62，(C)LC3B-II，(D)Tim23，(E)caspase-1的定量分析為測試蛋白相對于GAPDH的密度比。
自噬相關(guān)蛋白（P62、LC3B-II、Tim23和caspase-1）的蛋白水平通過Western印跡進(jìn)行了分析（圖7A）。與假組相比，CLP組的樣本顯示P62和LC3B-II水平升高，而CLP+H2組的樣本顯示這些蛋白的水平高于CLP組（圖7B和C）。此外，CLP組樣本的Tim23水平低于假組，而CLP+H2組樣本的Tim23表達(dá)水平進(jìn)一步降低（圖7D）。Caspase-1是炎癥反應(yīng)的重要生物標(biāo)志物。與假組相比，CLP組樣本的Caspase-1水平明顯升高，而2%H2處理則導(dǎo)致Caspase-1表達(dá)下降（圖7D）。在CLP+肽P組和CLP+H2+肽P組之間沒有觀察到所有這些蛋白水平的明顯差異（圖7B-D）。
這些結(jié)果表明，膿毒癥可提高FUNDC1誘導(dǎo)的有絲分裂水平，而這種效應(yīng)在2%H2處理后可進(jìn)一步增強(qiáng)。此外，F(xiàn)UNDC1抑制劑多肽P能有效阻斷敗血癥誘導(dǎo)的有絲分裂，并逆轉(zhuǎn)H2對敗血癥小鼠肝損傷的保護(hù)作用。
FUNDC1依賴性線粒體自噬及氫氣電極驗(yàn)證：氫氣緩解膿毒癥肝損傷的機(jī)制——引言、材料與方法
